為了獲得大量的AKP基因，我們需要將目的基因通過pcr擴增基因劑量，方便下一步實驗作基因重組。

我們需要注意PCR產物的準確性和產率。特別注意引物、復性溫度、taqE對準確性的影響和延伸時間（1000bp/min）、Mg2+濃度、循環數（小于等于30）對產率的影響。

同時，我們要掌握PCR基因擴增及擴增產物的回收的基本原理和實驗技術方法。

實驗原理及過程

實驗步驟

實驗原理

1 PCR體系的準備和PCR擴增的開始

2.5mmol/L dNTP Mixture 4.0uL

10xbuffer Mg2+ Ex－TaqE ddH2O 40uL

primer 4uL

模板DNA 2uL

940C,2’ 940C 1’ 420C 1’ 720C 2’ 720C 10’ I-------30cycles----I

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，即PCR技術。

在合適條件下，這種循環不斷重復，前一個循環的產物可作為后一循環的模板參與DNA的合成，zui終使產物DNA的量按2n方式擴增。

理論上講經過30次的循環反應，DNA擴增倍數為106-109。

PCR引物的設計至關重要，3’端要嚴格配對，5’可以引入酶切位點，也可以由此控制Tm值和CG的比值。

TaqE有zui適溫度和反應的活性，要注意它有加尾活性。

循環數超過30個以后，因為產物數量增加和反應物數量的減少，反應速度降低，這時對反映的產率已經沒有貢獻，反而副產物增多,影響效果。所以，循環數不應超過30。

2 PCR產物電泳

0.8 %Agarose（1×TAE） 80伏恒壓電泳

全部PCR產物上樣電泳：

6uL 10xloading

6uL SYBR

marker部分：

10uL marker（含loading buffer）

1uL SYBR

因為PCR產物會有一些副產物，所以要用電泳的方法分離各種PCR產物。這樣也能分離TaqE等雜質。

為了分辨PCR產物和PCR副產品，需要跑一個分子量marker，我們的產物是1.6kp。

用TAE的原因是高嚴可以降低Agarose熔點，促進之后的DNA 吸附。

3 PCR產物的回收（玻璃奶吸附法）

1)

紫外燈下切膠，稱膠重

SYBR會使DNA部分顯出綠色熒光，在紫外燈下辨認綠色熒光，可將膠切下。

2)

每100mg膠加入300 uL溶膠液，50 oC溶膠

讓DNA充分釋放到液體中。

3)

將在-20 oC凍存的玻璃奶解凍，振勻！！

玻璃奶為細微的玻璃小顆粒，因酷似奶狀而得名。它為懸濁液，而可以起吸附作用的小顆粒會沉降下來，所以，只有搖勻，我們才能渠道足量的玻璃小顆粒，完成分離的過程。

4)

在溶解后的膠液中加入10 uL玻璃奶，吹打均勻，冰浴沉淀10min， 10,000rpm離心1min，去上清。

這是一個類似于吸附層析的過程。DNA會特異的吸附于玻璃奶的小顆粒上，而膠不會吸附于其上，故可以起到分離的效果。

高鹽能促進吸附。

5)

在離心所得沉淀中加入200 uL稀釋濃縮洗膠液（3體積濃縮洗膠液加入7體積無水乙醇即得稀釋液），吹打均勻，10,000rpm離心1min，去上清，如此洗兩次。

這是一個洗滌的過程。

6)

50 0C干燥。

7)

加入20 uL TE，吹打均勻，60 oC 5-10min 溶解DNA，12,000rpm 2min，收集上清為回收的PCR產物，-20oC保存。

此步驟是解析。

讓DNA釋放到溶液中，李新的方法可以將DNA純化。

低鹽有利于解吸附。

8)

檢測是否含有DNA

取2uLDNA混合0.5uLSYBR，直接到紫外燈下觀察，若有綠色熒光，則證明有DNA存在。

實驗結果及分析
本次試驗中，在zui后一步檢測中看到了熒光，說明了DNA的存在，證明回收到了PCR的產物。