PCR基因擴增 步驟
[實驗目的]
通過本實驗學習PCR反應的基本原理與實驗技術。
[實驗原理]
多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）的原理類似于DNA的天然復制過程。在待擴增的DNA段兩側和與其兩側互補的兩個寡核苷酸引物，經變性、退火和延伸若干個循環后，DNA擴增2n倍。
1．變性：加熱 使模板DNA在高溫下（94℃）變性，雙鏈間的氫斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。
2．退火：使溶液溫度降至50-60℃，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結全，即退火階段。
3．延伸：溶液反應溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導下，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5’→3’方向復制出互補DNA，即引物的延伸階段。
上述3步為一個循環，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經過一個循環，樣本中的DNA量應該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環的模板，經過25-30個循環后DNA可擴增106-109倍。
典型的RCP反應體系由如下組分組成：DNA模板、反應緩沖、dNTP、MgCl2、兩個合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶。
[實驗儀器與設備]
1．PCR基因擴增儀
2．瓊脂糖凝膠電泳系統
[實驗材料]
1. DNA模板 2. 4種dNTP
3. 引物1和引物2 4. Taq酶
5. 瓊脂糖 6. DNA Marker
7. tip 8.eppendorf管
9. 微量移液器
附試劑的配制：
1. 10×PCR緩沖液
500mmol/L KCl
100mmol/L Tris·HCl(Ph8.3,室溫)
15mmol/L MgCl2
0.1% 明膠
2. 4×dNTP
10mmol/L dATP
10mmol/L dCTP
10mmol/L dGTP
10mmol/L dTTP
3. Taq酶 1u/μL
4. DNA模板 1ng/μL
5. 引物溶液濃度 10pmol/μL
[實驗步驟]
1．在0.5ml Eppendorf管內配制25μL反應體系
反應物 體積/μL
ddH2O 11
10×PCR緩沖液 2.5
2.5mmol/L dNTP 2.0
25mmol/L MgCl2 1.5
引物1 1.0
引物2 1.0
模板DNA 5
Taq酶 1
混勻,加25μL石蠟油.
2.按下述程序進行擴增
① 94℃預變性 5min
② 94℃變性 1min
③ 52℃退火 1min
④ 72℃延伸 1min
⑤ 重復步驟②-④35次
⑥ 72℃終延伸 10min
3．瓊脂糖凝膠電泳分析RCR結果
配制1.5%瓊脂糖凝膠，取10μL擴增產物電泳。保持電流40mA.電泳結束后，用EB染色15min,紫外燈下觀察結果。
[作業]
根據紫外燈下觀察的結果，畫出電泳示意圖，并討論PCR反應應注意的事項。
[實驗安排]
6學時
1天內可完成，上午做PCR反應，下午做電泳檢測。
