巨噬細胞培養
1.實驗前三天，向每只小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯1ml（勿注入腸內）。
2.引頸殺死動物，手提鼠尾將全鼠浸入70％酒精中3～5秒。
3.置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。
4.再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時從兩側用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內充分流動。
5.用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內。
6.小心拔出針頭，把液體注入離心管中，250g 4℃離心10分鐘，去上清，加10 ml Eagle培養基。
7.計數細胞，每只小鼠可產生20～30×105細胞，其中90％為巨噬細胞。
8.為獲取3×105個帖附細胞/平方厘米，需接種2.5×106/ml。
9.為純化培養細胞，去除其它白細胞，接種數小時后，去除培養液，用Eagle液沖洗1～2次后，再加新Eagle培養液置37℃ CO2溫箱中培養。
巨噬細胞培養
一、原理
在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞zui易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。
目前常用的保護劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。
二、操作步驟
凍存:
1.消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。
2.1000rpm離心10分鐘，棄上清液。
3.沉淀加含保護液的培養，計數，調整至5×106/ml左右。
4.將懸液分至凍存管中，每管1 ml。
5.將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現爆裂。
6.貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。
7.按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態氮（30分鐘）→液氮。
注意：操作時應小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，不能揮發干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
復蘇:
1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內裝2/3杯37℃的溫水。
2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融化。
3、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。
4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。
5、沉淀加10ml培養液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。
6、加適當培養基后將細胞轉移至培養瓶中，37℃培養，第二天觀察生長情況。
試劑和器材:
器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機等
試劑：0.25％胰酶、培養基、含保護劑的培養基（即凍存液）
附：凍存液配制：
培養基加入甘油或DSMO，使其終濃度達5—20%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4℃下保存。
