ATCC細(xì)胞 TSS方法制備感受態(tài)細(xì)菌(又稱(chēng)一步法)
一、 準(zhǔn)備工作
1、 緩沖液1×TSS的配制:
事先配制1M的氯化鎂——20.3g氯化鎂(6分子水結(jié)晶)/定容于100ml去離子水后封裝,不用滅菌。
取 干凈的100ml 量筒和100ml 燒杯,用量筒量取100ml去離子水,加入至燒杯中,取 1 g 蛋白胨,0.5g酵母抽提物,0.5g氯化鈉,10 g PEG(MW= 3350), 5ml DMSO,5ml 的1 M氯化鎂,溶解后用鹽酸或者氫氧化鈉調(diào)整pH為6.5,混勻后用0.22um 濾器過(guò)濾除菌。儲(chǔ)存在4度,保質(zhì)期約6個(gè)月。
ATCC細(xì)胞 TSS方法制備感受態(tài)細(xì)菌(又稱(chēng)一步法) 2、已劃平板(或者用槍頭沾取并稀釋后涂布)并在培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)的菌種——Dh5α,用于接種并振蕩培養(yǎng)。.兩個(gè)錐形瓶,分別裝有30 ml和50mlLB,滅菌后置于4℃冰箱備用。
3、 若干已滅菌的瓊脂平板,一個(gè)未加抗生素,用于第二步的接種。其余做轉(zhuǎn)化用。
ATCC細(xì)胞 TSS方法制備感受態(tài)細(xì)菌(又稱(chēng)一步法) 二、 感受態(tài)制備程序:
1、 前一天晚上調(diào)單菌落至30 mlLB中過(guò)夜培養(yǎng)(12-16h),按1:100 比例將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液(500ul)加入到新鮮的50 ml LB培養(yǎng)液中,于37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4(培養(yǎng)時(shí)間2h40~50min)。冰浴30分鐘后4度1000g離心10min,棄上清,收獲細(xì)菌。加入原體積十分之 一(這里為5 ml)的1× TSS 液(冰預(yù)冷)懸浮細(xì)胞,然后分裝成100 ul/份,全部冰上操作,-80度保存。
三、 轉(zhuǎn)化時(shí)取一管(100 ul)感受態(tài)細(xì)菌,(凍存細(xì)胞應(yīng) 置于冰上緩慢融化后立即使用)加入3-5ul DNA(0.1~100ng),輕輕混勻后冰浴30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培養(yǎng)液,37度150r/min溫和振蕩培養(yǎng) 60min,涂布,室溫放置約20分鐘后放于37度恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)(17-20h)