原代細胞株的培養實驗
實驗目的和要求：
掌握無菌操作技術。
了解小鼠解剖操作技術。
了解原代細胞培養的一般方法與步驟
了解培養細胞的消化分散。
了解細胞計數方法。
了解倒置顯微鏡的使用。
實驗原理：
原代細胞株的培養實驗
是將機體內的某組織取出，分散成單細胞，在人工條件下培養使其生存并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖、細胞的接觸抑制、以及細胞的衰老，死亡等生命現象。
實驗內容：
動物的選擇：
選擇大約一半足孕時間的胚胎，10－13天齡胚胎含有zui大數量的未分化的間質細胞，成纖維細胞可從這些細胞衍生獲得。
每組小鼠胚胎1個
實驗材料：
每組的超凈臺中有以下物品：
1. 50ml 配制好的RPMI1640培養液1瓶；8ml小牛血清（FCS） 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS（-）1 瓶
2. 100ml滅菌燒杯2個；
3、50ml離心筒2個
4、滅菌培養皿1個，細胞培養瓶1個
4、1ml ，200μl移液器各1支；槍頭盒2個；無菌玻璃攪拌棒1個
5、細胞計數板1塊；
6、滅好菌的鑷子1把，剪刀1把；
7、酒精燈1臺；
原代細胞株的培養實驗 試驗操作步驟：
1）胚胎的分離。適用哺乳動物（倉鼠、小鼠和大鼠）
a．采用認可的方案處死嚙齒動物。
b．立即在無菌超凈臺內用70％乙醇擦洗整個動物。
c．用無菌的鑷子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。
d．用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培養皿上。
e．剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的100ml燒杯中。
f．漂洗胚胎，去掉PBS。繼續用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。
2）將1－2個胚胎轉移至一個小的無菌培養皿中，用新的無菌剪刀小心地絞碎胚胎， 用PBS漂洗。
3）在無菌狀態下，將絞碎的胚胎轉移于一50ml 的無菌離心筒中, 加入40ml 0.25％的無菌胰蛋白酶,用攪拌棒輕輕攪動 。
4）在溫暖的環境中或置于37 °C培養箱中輕輕搖動15分鐘。
5）讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含有懸浮細胞的液體轉移至一無菌50ml的離心管中，該管內按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以滅活,胰蛋白酶。
6）加人新鮮胰蛋白酶溶液（見前述步驟）于含有殘留未消化組織塊的原來的50ml離心筒中，重復步驟4和5。
7）離心混合的細胞懸液，1200r/rain，5分鐘，棄上清。
8）用新鮮的無菌PBS重懸沉淀的細胞，按步驟7再次離心。
9）用PBS反復洗滌細胞直至上清清亮為止。
