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Caspase 3熒光法檢測試劑盒(AFC)

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產品型號

品       牌

廠商性質其他

所  在  地上海市

更新時間:2022-05-12 10:46:17瀏覽次數:501次

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貨號 BJ-01X6369
Caspase 3熒光法檢測試劑盒(AFC)公司正在出售的產品:0.312-20 ng/mL 新城疫病毒(NDV)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法) 0.78-50 ng/mL 人層粘連蛋白亞基α-3(Laminin subunit alpha-3)ELISA試劑盒 0.156-10 ng/mL ELISA Kit for Human Leukocyte-associated immunoglo

細胞培養操作規程:

一.培養基及培養凍存條件準備:

1) 準備F-12K培養基;優質胎牛血清,10%;雙抗,1%。

2) 培養條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37℃,培養箱濕度為70%-80%。

3) 凍存液:90%血清,10%DMSO,現用現配。

二. 細胞處理:

1) 復蘇細胞:將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于凍存管蓋部)搖晃解凍,移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2) 細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養。

中文名稱:Caspase 3熒光法檢測試劑盒(AFC)

英文名稱:Caspase-3 Fluorescence Metric Assay

產品規格:20T|50T|100T

產品貨號:BJ-01X6369

本試劑盒適用于培養細胞及新鮮組織caspase-3 檢測。Caspase 家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用,其中caspase-3 為關鍵的執行分子,與DNA 斷裂、染色質凝聚和凋亡小體形成有關。Caspase-3 在正常狀態下以酶原的形式存在于胞漿中,沒有活性;但在細胞發生凋亡階段,它被激活,活化的Caspase-3 由兩個大亞基和兩個小亞基組成,裂解相應的胞漿胞核底物,終導致細胞凋亡。Caspase-3 熒光檢測試劑盒就是將caspase-3 序列特異性的多肽偶聯至發色基團。當底物被Caspase-3 剪切后,發色基團即游離出來,可通過熒光酶標儀測定其熒光強度(激發波長=485nm,發射波長=535nm)。

注意事項

1. Caspase-3 Substrate 避光保存及使用。

2. 對某些凋亡誘導劑引起的細胞凋亡可能存在非依賴于Caspase-3 活化的機制,這種情況時利用本試劑盒檢測Caspase-3 活性無明顯改變,需要考慮凋亡機制中的其他信號通路。

3. 細胞數量需達到3~5×106 個或新鮮組織50~100mg,以便能達到測定需要的100~200μg 蛋白的要求,因為Caspase-3 的活性與細胞裂解液的蛋白含量有關,如測定的RFU 值偏低,可以通過適當延長反應的時間,如果值還是不高,可通過增加細胞數量或組織量的方法來提高蛋白量。


QQ截圖20220509112004.png

細胞培養方法:

1、細胞傳代:細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%(T25瓶),使覆蓋整個瓶或皿,蓋好放入培養箱消化;

③1-2min后,顯微鏡下觀察細胞,若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化;若細胞還是貼壁,放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止;

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清;

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中,T25培養瓶加6-8ml培養基;

⑥懸浮細胞直接離心收集,細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇:

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,時間1min左右,加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1-2ml培養基吹勻,將細胞懸液加入培養瓶中,補加適量培養基。

3、細胞凍存:待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次,加入1mL 0.25%(T25瓶)

②1-2min后,顯微鏡下觀察細胞,大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化;

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1ml凍存液重懸細胞;

④將凍存管放入程序降溫盒,放入-80℃冰箱,4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

操作規程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔,通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞,細胞毒性實驗每孔加入100微升5000~10000個細胞(具體每孔所用的細胞的數目,需根據細胞的大小,細胞增殖速度的快慢等決定)。置37℃ 5%CO2細胞培養箱培養24小時.

2、.加入適當濃度的0~10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃,含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液,在37℃孵育4小時,使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液,每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解,用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度(如無570nm 濾光片,可以使用560-600nm 的濾光片)。

8、結果分析

a、細胞的存活率:將各測試孔的OD 值減去本底OD 值(*培養基加MTT,無細胞)或空白藥物孔OD 值(*培養基加受試藥物的不同稀釋度加MTT,無細胞),各重復孔的OD 值取平均數±SD。細胞的存活率以T/C%表示,T 為加藥細胞的OD 值,C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =(加藥細胞OD/對照細胞OD)×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

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