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免疫組化實驗常見問題和解決方法

閱讀：414發布時間：2017-10-31

免疫組化實驗常見問題和解決方法

染色過強

原因解決方法
抗體的濃度過高或抗體孵育時間過長

降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體） 抗體孵育時間：室溫1小時或4℃過ye

孵育溫度過高，孵育溫度超過37℃一般室溫20-28℃
DAB 顯色時間過長或 DAB 濃度過高顯色時間不能超過5-10分鐘，以顯微鏡下觀察為準

非特異性背景染色

原因解決方法
操作過程中沖洗不充分每步沖洗3×5
組織中含過氧化物酶未阻斷可再配置新鮮3%H2O2封閉，孵育時間延長
組織中含內源性*正常非免疫動物血清再封閉
血清蛋白封閉不充分延長血清蛋白封閉時間

染色弱

原因解決方法
抗體濃度過低，孵育時間過短提高抗體濃度，孵育時間不能少于60分鐘
試劑超過有效使用期及時更換試劑
操作中，滴加試劑時緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥）
室溫太低，低于15℃若室溫低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分鐘（或4℃冰箱過ye）
蛋白封閉過度封閉時間不要超過10分鐘

染色陰性

原因解決方法
操作步驟錯誤重新試驗，設立陽性對照
組織中無抗原設立陽性對照片，以驗證實驗結果
一抗與二抗種屬連接錯誤仔細確定一抗與二抗種屬無誤
 

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