墨吉明對蝦蛻皮抑制激素MIH1基因克隆、表達及功能研究
墨吉明對蝦(Fenneropenaeus merguiensis)蛻皮抑制激素(molt-inhibiting hormone,MIH),屬于甲殼動物高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone,CHH)家族神經肽,由眼柄神經內分泌調控中心X器官-竇腺復合體(X-organ-sinus-gland,XO-SG)合成分泌。蛻皮抑制激素和蛻皮類固醇激素(molting hormone,MH)相互拮抗而調控蛻皮活動,并且其在甲殼動物的生長、繁殖和滲透壓調節等一系列活動中發揮重要作用。近年來,隨著墨吉明對蝦遺傳育種工作的開展,因此對其生長、繁殖、蛻皮等相關基因的克隆、表達及功能研究意義重大。本研究利用RT-PCR和RACE技術克隆獲得墨吉明對蝦蛻皮抑制激素MIH1的cDNA、gDNA全長并對其進行生物學特性描述;運用實時熒光定量PCR技術檢測了MIH1基因在墨吉明對蝦不同組織、不同蛻皮時期的表達分布;同時運用原核重組表達技術成功獲得FmMIH1重組蛋白,注射FmMIH1重組蛋白和雙鏈對MIH1進行功能研究。FmMIH1擁有二型眼柄神經肽CHH/MIH/GIH家庭的大部分特征。FmMIH1開放閱讀框(ORF)大小為318 bp,編碼105個氨基酸殘基。FmMIH1成熟肽由76個氨基酸殘基組成,第11位的*殘基和6個半*殘基位于成熟肽的保存位置。FmMIH1基因由2個內含子和3個外顯子組成。同源性分析表明Fm MIH1在功能結構域上較為保守,與斑節對蝦MIH1、凡納濱對蝦MIH1同源性(99%、98%)。系統發育分析結果也表明FmMIH1與甲殼動物長尾類聚為一支,其中與斑節對蝦MIH1,凡納濱對蝦MIH1親緣關系近。除了眼柄,在腸道中也可以檢測到FmMIH1高水平表達。FmMIH1在整個蛻皮后期、蛻皮間期的早期、中期階段和蛻皮前期的表達水平很低;但在蛻皮間期(C3)檢測到FmMIH1表達水平大幅增加。對于功能研究實驗,RNA干擾結果顯示,注射dsFmMIH1的實驗蝦,其蛻皮周期明顯縮短了2.7天(P<0.05);意料之外的是,注射Fm MIH1重組蛋白的實驗蝦,其蛻皮周期也平均縮短了1.8天(P<0.05)。因此推測該重組蛋白可能是生物惰性蛋白,這部分結構與內源MIH1競爭性結合其運輸蛋白,因此減少了能夠到達靶位點的生物活性MIH1。總之,這項研究結果為我們進一步研究甲殼動物的蛻皮、生長提供新的見解。
