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技術文章

大腸桿菌雜交

閱讀:377發布時間:2016-1-25

實驗說明

    大腸桿菌中除了不同型細胞的接合外,同型細胞F+與F+或*即濃度為使用濃度的50倍。**將稱好的藥品分別溶解于670毫升蒸餾水中,待一種藥品溶解后再放另一種藥品,直至全部藥品都溶解,然后加水定容到1.000毫升。***瓊脂的添加量由1.5—2克,根據瓊脂的質量而定。凝固性能好的瓊脂,可少加一些,反之,則要多加一些。Hfr與Hfr也能接合,但重組頻率很低。細胞中的F因子使細胞壁的抗原發生了變化,這些不同于F性菌毛的表面成分阻止了F+與F+細胞雜交。經培養后處于饑餓條件下的F+細胞喪失了它們的表面排斥性,才能與其它F+細胞接合(這種改變是暫時的,一旦在新鮮培養基中,繼續生長正常的表面特性又恢復),這些表型上的“F-細胞”稱為擬表型。在抑制新的F性菌毛和表面成分形成的條件下生長,如低溫下連續通氣培養24—48小時,能增加擬表型的百分數。

實驗步驟

1.菌液制備:

(1)實驗前14—16小時,從冰箱保存的斜面菌種,挑少量菌于盛有5毫升*液體培養基的三角燒瓶中;每一個菌株接種一瓶,共接種4瓶,置37℃培養過夜。

(2)取出培養過夜的細菌,在W1177一瓶菌液中加入5毫升新鮮的*培養液,充分搖勻,等量分成2瓶;其余3瓶菌液分別用滅菌的5毫升吸管,各吸出2.5毫升菌液,然后再各加入2.5毫升新鮮的*培養液,充分搖勻,各菌于37℃繼續培養3—5小時。

(3)自溫箱取出三角燒瓶,分別倒入離心管,菌株W1177倒二支離心管,其余菌株各倒入一支離心管,離心沉淀,3,500轉/分,離心10分鐘。

(4)倒去上清液,打勻沉淀,加入無菌水,離心洗滌3次,再加無菌水到原體積。

2.雜交——混合培養:

(1)取12支滅菌試管,每支吸入3毫升經融化的半固體培養基,并保溫在45℃(保溫溫度不宜高,北方氣溫低,可降低半固體中的瓊脂量)。

(2)12支試管分成三個雜交組合,即W1177×K12pro;W1177×W1485;W1177×HfrC。每個組合各4支試管,其中2支對照,2支混合菌液。

(3)對照組試管各吸F+或Hfr供體菌菌液1毫升,其余按雜交組合各吸供體菌和受體菌菌液0.5毫升,充分混勻。

(4)將各試管中含菌的半固體倒在有Vogel培養基底層的平板上,搖勻待凝,放37℃培養,48小時后觀察


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