濕色培養(yǎng)基制備方法：
步驟一，將氧化鉍粉碎至規(guī)定平均粒徑；
步驟二，配制預(yù)定濃度的檸檬酸水溶液并加熱至低于水沸點的預(yù)定溫度；
步驟三，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)方程式Bi203+2C6H807 = 2C6H5Bi07+3H20使得檸檬酸水溶液中的檸檬酸的初始過量系數(shù)保持在I以下，，將粉碎的氧化鉍逐步添加到所述加熱的檸檬酸水溶液中，以使檸檬酸與氧化鉍進(jìn)行反應(yīng)；
步驟四，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，逐步補(bǔ)加另一濃度的檸檬酸水溶液，以保持初始的液固比；
步驟五，反應(yīng)結(jié)束后，過濾并烘干，即獲得檸檬酸鉍制品。
其中，檸檬酸的 初始過量系數(shù)是指在根據(jù)化學(xué)反應(yīng)式計算理論所需的檸檬酸的量的基礎(chǔ)上多加入的檸檬酸的摩爾數(shù)；初始液固比指氧化鉍和檸檬酸溶液反應(yīng)前的液體和固體的質(zhì)量比。
實驗經(jīng)驗總結(jié)
1、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識別，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時，師兄都嚴(yán)格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。還有有的包被原可能不是蛋白，對于*和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被，我把方法簡要的列出如下:①親和素*:先親和素先包被載體，加入*化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。②脂類物質(zhì):可將其在有機(jī)溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。
2、包被液的選擇，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于試驗的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包。應(yīng)注意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用，這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗還要有堅固的理論外也要實踐，看一下zui終可不可以應(yīng)用到自己試驗當(dāng)中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
3、封閉：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價廉，可以高濃度使用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等。但zui終選用什么，要依據(jù)試驗具體來實踐。
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