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試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被微生物白喉毒素（Diphtheria）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、陰性和陽(yáng)性對(duì)照、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色。顏色的深淺和樣品中的微生物白喉毒素（Diphtheria）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），判定陰陽(yáng)性。

樣本處理及要求

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?/font>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/font>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將*碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?/font>-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

需要而未提供的試劑和器材

酶標(biāo)儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱
蒸餾水或去離子水

試劑盒組成

名稱	96孔配置	48孔配置	備注
微孔酶標(biāo)板	96孔	48孔	無(wú)
陰性對(duì)照	0.3mL	0.3mL	無(wú)
陽(yáng)性對(duì)照	0.3mL	0.3mL	無(wú)
*	6mL	3mL	無(wú)
檢測(cè)抗體-HRP	10mL	5mL	無(wú)
20×洗滌緩沖液	25mL	15mL	按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋
底物A	6mL	3mL	無(wú)
底物B	6mL	3mL	無(wú)
終止液	6mL	3mL	無(wú)
封板膜	2張	2張	無(wú)
說(shuō)明書	1份	1份	無(wú)
自封袋	1個(gè)	1個(gè)	無(wú)

注意事項(xiàng)

嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉。
消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。
在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
不能使用過(guò)期產(chǎn)品。
如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。

試劑準(zhǔn)備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

操作步驟

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
設(shè)置陰性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔，陰性、陽(yáng)新對(duì)照孔各加50μL對(duì)照品；
樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL；空白孔不加。
除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。