背景資料：

DNA中的5-甲基胞嘧啶（5-mC）通過DNA甲基轉移酶在胞嘧啶環的5個碳原子上共價加成甲基而產生。這個過程已經被充分研究，并且通常與基因表達的抑制有關。還觀察到在人類中，5-mC存在于各種RNA分子中，包括tRNA，rRNA，mRNA和非編碼RNA（ncRNA）。5-mC似乎在某些類別的ncRNA中富集，但在mRNA中相對耗竭。5-mC的水平在動物基因組中是可變的，范圍從某些昆蟲中無法檢測到的量到人類細胞中總RNA的約0.1-0.45％。在mRNA中發現了大多數的5-mC位點（83％）。在這些轉錄物中，5-mC似乎在蛋白質編碼序列中被耗盡，但富含5'和3'UTR。兩種不同的甲基轉移酶 已知NSUN2和Dnmt2催化真核RNA中的5-mC修飾。有強有力的證據表明，RNA胞嘧啶甲基化會影響各種生物學過程的調控，例如RNA穩定性和mRNA翻譯。

艾美捷MethylFlash總5-mC RNA甲基化定量分析試劑盒包含 5-mC RNA 甲基化定量實驗所需的所有最佳化試劑，可以使用任何物種的 total RNA 樣品來進行實驗，如哺乳動物、植物、真菌、細菌和病毒等，無論是從培養細胞、新鮮或冷凍的組織、血漿/血清或體液等來源皆可適用。  

總5-mC RNA甲基化定量分析試劑盒的原理和步驟：

該試劑盒包含所有用于定量5-mC RNA甲基化的試劑。在測定中，RNA結合到經過特殊處理以具有高核酸親和力的條帶孔上。使用捕獲和檢測抗體檢測RNA中的5 mC，然后通過在微孔板分光光度計中讀取熒光進行熒光定量。5-mC RNA的百分比與測得的熒光強度成正比。

總5-mC RNA甲基化定量分析試劑盒用戶指南：

用途：MethylFlash™ 5-mC RNA甲基化ELISA簡易試劑盒（熒光法）適用于使用從任何物種分離的總RNA檢測全球5-mC RNA甲基化水平，包括各種形式的哺乳動物、植物、真菌、細菌和病毒，包括但不限于培養的細胞、新鮮和冷凍組織、血漿/血清樣本和體液樣本等。

輸入RNA：每次測定的RNA量可以為50至300 ng。對于最-理想的定量，輸入的RNA量應為200納克，因為RNA中的5-mC因組織而異，可能更少在某些物種中占總RNA的0.1%以上。

起始材料：起始材料可以包括各種組織或細胞樣本，例如培養的細胞、新鮮和冷凍組織、血漿/血清樣品、體液樣品，等。

內部對照：本試劑盒中提供了陰性和陽性RNA對照。標準曲線可以進行（范圍：0.05%至2%）。由于RNA中的全局5-mC可因組織而異，從正常和患病狀態，建議運行重復樣本，以確保信號生成的驗證。該試劑盒將允許用戶量化RNA中5-mC的絕對量確定兩個不同RNA樣品的相對5-mC狀態。

注意事項：為避免交叉污染，請小心地將樣品或溶液移到帶狀孔中。使用氣溶膠屏障移液管吸頭，并始終在液體轉移之間更換移液管的吸頭。穿在整個過程中戴手套。如果手套與樣品接觸，更換手套立即。

艾美捷MethylFlash總5-mC RNA甲基化定量分析試劑盒原則和程序：

圖1：最佳標準曲線示例用5-mC標準對照產生。 

圖2：準確定量各種使用MethylFlash 5-mC RNA甲基化ELISA簡易套件（熒光計）。結果密切相關與通過MS-LC獲得的那些相同。