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微生物實驗用菌種如何保存的方法（二）
閱讀：96 發布時間：2024-6-33.2.2 液體石蠟保存法：將液體石蠟分裝于三角燒瓶內，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎， 121℃滅菌30分鐘，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發掉，備用。將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養基中培養，使得到健壯的菌體或孢子。用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長）。
大腸桿菌、、假單胞桿菌屬、沙門氏菌屬、副傷、李斯特氏菌屬、、八疊球菌、短芽孢桿菌、大腸桿菌HB101、大腸桿菌DH5a、豬肺疫、禽多殺性巴氏桿菌（禽霍亂）、豬丹毒、大腸桿菌O157、大腸菌群、產氣腸桿菌、志賀氏菌屬；接種于半固體培養基上，36±1℃培養18-24小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。注：副溶血性弧菌接種于含鹽的半固體培養基上，36±1℃培養18-24小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于室溫。
產氣莢膜梭菌、梭桿菌屬、擬桿菌屬等厭氧菌、厭氧消化鏈球菌：接種于CDC厭氧菌瓊脂中，培養18-24小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。酵母菌：接種于YPD培養基中，28℃培養24-48小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。霉菌、白色念珠球菌：接種于PDA培養基中，28℃培養24-48小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。鏈球菌屬：接種于羊血瓊脂，36±1℃培養24-48小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。副嗜血桿菌、淋病奈瑟菌(需5-10%CO2環境)、腦膜炎奈瑟菌(需5-10%CO2環境)、流感嗜血桿菌接種于巧克力瓊脂，36±1℃培養24-48小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。分枝桿菌屬：接種于改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂36±1℃培養7天，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。
4.菌種制備。菌種制備按照批準的制備計劃執行。制備中要按規范要求操作，同時做好工作記錄。記錄內容包括：菌種名稱，傳代標識、制備數量。在制備容器上作出明確表示。 具體菌種制備方法如下：可以麥氏比濁管計數每ml菌液的菌數
1）大腸桿菌、、假單胞桿菌屬、沙門氏菌屬、副傷、李斯特氏菌屬、、八疊球菌、短芽孢桿菌、大腸桿菌HB101、大腸桿菌DH5a、豬肺疫、禽多殺性巴氏桿菌（禽霍亂）、豬丹毒、大腸桿菌O157、大腸菌群、產氣腸桿菌、志賀氏菌屬；把各種細菌菌種劃線接種于營養瓊脂平板上，36±1℃培養18-24小時，挑取單菌落接種于10ml營養肉湯中，36±1℃培養18-24小時，計數出每ml營養肉湯中的細菌數。把菌液保存于2-8℃，此菌液可保存7-10天，每10天重新挑取單菌落接種于10ml營養肉湯中， 36±1℃培養18-24小時，用生理鹽水稀釋到10-7，計數出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml營養肉湯中的細菌數。
2）產氣莢膜梭菌、梭桿菌屬、擬桿菌屬等厭氧菌、厭氧消化鏈球菌等厭氧菌直接接種于10ml液體硫乙醇酸鹽培養基中，36±1℃培養18-24小時，計數出每ml液體硫乙醇酸鹽培養基中的細菌數（在厭氧條件下培養）。
3）酵母菌、霉菌和白色念珠球菌：接種于PDA培養基中，28℃培養24-48小時，挑取單菌落接種于10ml葡萄糖蛋白胨培養基中，28℃培養24-48小時，用YPD瓊脂計數出每ml葡萄糖蛋白胨培養基中的菌落。把菌液保存于2-8℃，此菌液可保存7-10天，每10天重新挑取單菌落接種于10ml葡萄糖蛋白胨培養基中，28℃培養24-48小時，用生理鹽水稀釋到10-7，計數出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml葡萄糖蛋白胨培養基中的菌數。
4）鏈球菌屬：接種于腦心浸液中36±1℃培養18-24小時，計數出每ml腦心浸液中的細菌數。把菌液保存于2-8℃，此菌液可保存7-10天，每10天重新挑取單菌落接種于10ml腦心浸液中， 36±1℃培養18-24小時，用生理鹽水稀釋到10-7，計數出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml腦心浸液中的細菌數。
5）副嗜血桿菌、淋病奈瑟菌(需5-10%CO2環境)、腦膜炎奈瑟菌(需5-10%CO2環境)、流感嗜血桿菌接種于巧克力瓊脂，36±1℃培養18-24小時，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，經比濁后制成每1ml含菌數約相當于100～1000cfu的菌懸液。
6) 分枝桿菌屬：接種于改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂36±1℃培養7天，用0.9%無菌氯化鈉溶液將上述增菌培養后的質控菌種的新鮮培養物制成1.0~3.0×103CFU/ml的菌懸液，作為工作菌液。
5．菌種的標識和使用期限：標識：菌種代數的計算為干粉菌種為第0代，轉接一次斜面加一代。具體標識為：例單增李斯特氏菌ATCC19114第0代，表識為單增李斯特氏菌ATCC19114-0，第一代表識為單增李斯特氏菌ATCC19114-1；第一代有12支，則表識為單增李斯特氏菌ATCC19114-1-1、……、單增李斯特氏菌ATCC19114-1-12；使用期限：傳代次數不得超過5代，菌種已變異或生化鑒定不符合；
6.菌種使用。菌種管理員，每月領取1支第一代(或第二代、第三代)菌種。再根據以上方法制備工作菌液，分發給實際使用者，實際使用者領用前應充分考慮重復實驗的需要。同一實驗要選擇同代菌種，保證實驗的可比性。領用菌種要詳細登記，領用人要簽字，并注明領用時間。
7.菌種處理。實驗完畢的菌種遺留物和污染物應嚴格按照三廢處理規定執行。提供給外部的菌種必須經公司總經理批準，按規定要求包裝運輸。嚴禁私自對外提供菌種。