與所有的檢測方法一樣，western blot數據的質量和定量是在檢測過程中薄弱、變化多的環節。準確度和重現性差的步驟將限制western blot定量程度。小編提供了實用的實驗操作的建議，關于如何獲得高質量的、定量的western blot數據，以便您可以得出穩定的實驗結果。

1.定量的定義

在討論如何從western blot中獲得定量數據之前，先定義一下我們所說的“定量”是什么意思是很有用的，何為定量，必須符合下列準則：

? 使用一個定義的過程進行測量，即western blot
? 這個過程產生一個可重復的結果，即是度
? 測量反映了一個“真實”的結果，即是準確度

Western blot過程需要明確定義以及盡可能保持一致的步驟，數據需要可重復，并且數據應該與使用正交方法收集的數據一致，例如質譜分析法。

在本文中，我們將重點討論如何滿足這些標準，強調在哪些地方需要特別注意一致性或執行試劑驗證和質控，可以獲得western blot可靠性和重現性的數據。

2.使用相同的方法處理樣品

一致的樣品制備和處理是產生定量western數據的重要的步。甚至是孵育時間、buffer成分或溫度上的微小差異(可變的室溫，在-20℃冷凍與在冰上保存)，也會顯著降低western blot數據的重現性。一旦建立了可靠的細胞或組織裂解和樣品處理方案，在準備相互比較的樣品時，應盡可能地遵循該程序。

3.抗體驗證

期刊雜志需要一些抗體驗證的信息，事實上，對于檢測感興趣蛋白，這是一個很好的實驗技術，在你自己的實驗室里用你自己的樣本和技術來驗證抗體。這在使用以前從未發表過的抗體時尤其重要。

僅僅驗證你的抗體檢測到蛋白在預期分子量是不夠的。重要的是要表明結合是特定于目標蛋白的，通過多種方法。抗體驗證工作組已經發布了一套很好的建議，其中列出了五種不同的抗體驗證方法。其中四種適用于驗證Western blotting中使用的抗體，我們在這里總結了這些驗證方法。

? 基因驗證：通過敲除基因或通過RNAi消除目標蛋白的翻譯，通過顯示蛋白表達信號被消除或減少來證明抗體的特異性。
? 正交驗證：證明使用抗體測量蛋白豐度與使用質譜法等正交方法測量蛋白豐度有很大相關性。
? 獨立抗體：證明使用你自己的抗體測量蛋白豐度與使用第二種已驗證的抗體測量蛋白豐度密切相關，該抗體可以識別同一目標蛋白上不同的、不重疊的表位。
? 標記蛋白表達(這是獨立抗體方法的一種特殊變體)：表達一個帶有附加表位標簽的靶蛋白，并指出使用你自己抗體測量蛋白豐度與使用識別表位標記的驗證抗體測量蛋白豐度相關性。

請注意，抗體驗證是特定于應用程序的——為ELISAs驗證的抗體不為western blotting驗證(反之亦然)，因為結合發生在明顯不同的條件下。

4.驗證信號線性，優化動態范圍

為了從western blot中獲得準確的測量結果，您需要確保檢測到的信號與當前的蛋白量成正比，換句話說，檢測在線性范圍內。然而，在western blotting過程中有多個步驟可以導致信號飽和，因此需要在每個步驟中驗證信號的線性。注意，其中許多步驟還可以優化，以大限度地提高信號的動態范圍。

驗證所使用的樣本量在線性范圍內

為了獲得穩健的定量蛋白印跡數據，我們建議生成一條標準曲線，涵蓋您將評估的全部樣品量，測試每個量的多個重復樣品（圖1）。信號強度與樣本量的關系圖將表明您可以加載多少蛋白，并且仍然可以確信您的信號處于線性范圍內。

請注意，應確定每個抗體 - 蛋白對應的系統線性范圍。

檢查轉印條件對信號線性的影響

膜能容納蛋白的數量可能飽和。我們建議測試幾個轉印時間，并選擇可形成線性信號的短時間。如果在測試的所有轉印時間信號都保持飽和狀態，那么很可能是其他的步驟導致了信號飽和。在這種情況下，可以繼續優化其他參數，然后返回轉印時間，驗證膜容量是否飽和。

滴定抗體

我們建議針對您期望檢測的全部靶蛋白量測試不同的抗體稀釋度。 這將確保您的檢測靈敏度足以檢測低量的目標蛋白，并且具有足夠寬的動態范圍，可檢測到zui高量的蛋白仍處于線性范圍內（圖2）。

圖2.滴定一抗，尋找*稀釋倍數。在10 mL Azure化學發光封閉緩沖液中
加入三種不同量的一抗，其他western blot條件不變。*抗體加入量是5 μL。

優化圖像采集時間

評估線性的后一步是印跡到檢測系統的曝光時間，無論是膠片還是數字成像儀或掃描儀。 都需要有個合理的曝光時間保證能檢測到弱信號蛋白同時強信號蛋白還不過曝，仍處于線性范圍內。

選擇合適的底物液用于定量化學發光western blot

通過適當的質控和正確的ECL底物化學發光也可以定量。選擇一個動態范圍廣，靈敏度高，半衰期長的底物液進行可靠和可重復的定量。

動態范圍受檢測技術的影響

膠片的動態范圍通常在1 log范圍內，這是一個相當窄的動態范圍。相比之下，PMT（光電倍增管）的動態范圍可以在大約6.3log。

5.總蛋白歸一化

歸一化對于可靠的western blot定量是至關重要的——通過找到一個期望在不同樣品和條件下保持不變的量，您可以質控樣品制備、上樣和轉印的變化，并生成目標蛋白對該不變特征的相對值。

一種廣泛使用的方法是使用看家蛋白進行歸一化，例如GAPDH， tubulin和 actin，其被認為具有穩定且不變的表達水平。 近的一系列研究表明這種假設有很多缺陷，現在許多免疫印跡專家和科學期刊，如Journal of Biological Chemistry雜志，建議使用總蛋白進行歸一化。而不是看家蛋白質，除非用于歸一化的看家蛋白進行穩定表達驗證2,4,5,6

6.使用一致的western blot協議

仔細嚴格地遵循既定方案有助于減少變異性并提高測量度，從而實現穩健的定量蛋白印跡。 您不僅應該通過使用相同的試劑或實施批次對照來減少變異性，保持孵育和洗滌時間相同也有助于確保一致和可靠的結果。