近年來，隨著檢測參數越來越多，流式細胞儀也日漸普及。不過，盡管多個參數同時分析可帶來大量信息，但在樣品制備過程中必須采取適當的措施，才能保證流式數據是相關的。如何才能少走彎路，下面聽聽各位專家的建議。

1. 從采集那一刻開始

流式分析所用的樣品是十分多樣化的，從細胞、血液到組織等。這些需要不同的樣品采集和處理方法。“血液或組織樣品通常在分析前幾天、幾周甚至幾個月采集，比如大型隊列研究，”美天旎的產品經理Johannes Fleischer解釋說，“若保存不當，可能會影響結果。為了實現高度標準化，建議使用專門的組織保存試劑、冷凍干燥或保存在-80℃，以減少實驗可變性。”

2. 是否需要富集細胞？

BioLegend的技術服務專家Ekaterina Zvezdova表示：“通常，人們利用抗體或細胞因子等刺激物處理后，使用流式細胞儀來評估細胞的活化狀態。然而，對細胞的刺激往往會導致表面受體內化。例如，抗CD3抗體對T細胞的刺激導致T細胞表面的TCR/CD3復合物下調，因此無法通過CD3或TCR分子來鑒定異質群體中的T細胞。”

他認為，研究人員需要預測不同處理方式對特定細胞標志物的影響，從而制定有效的策略來收集數據。比如，在細胞鑒定時采用替代性的譜系標志物，或者在刺激之前就富集感興趣的細胞亞群。

Fleischer也強調了富集細胞的好處。他解釋說，稀有細胞，比如循環腫瘤細胞、造血干細胞和抗原特異性T細胞，在流式實驗中是很難捕獲的。“使用與抗體偶聯的磁珠，可以富集這些稀有細胞，”他說。美天旎的MACSQuant Analyzer流式細胞儀可與磁性富集柱相整合，從而實現自動化的細胞富集。

3. 解離細胞有何影響？

*，流式分析需要單細胞懸液，因此當研究人員分析實體組織的細胞時，首先需要解離樣品。機械解離和酶解消化都是常用的方法，但兩者都會引起細胞應激，并導致細胞存活率不高。

“為了提高重復性，我們開發出GentleMACS?解離設備，這種自動化的儀器帶有預先設好的程序，可以更溫和地解離特定的生物材料，”Fleischer解釋說。“我們還設計出一系列組織特異性的解離緩沖液，作為GentleMACS設備的補充。我們已經生成了大量的測試數據，證明它們可以更好地保留細胞表面的表位。”

Zvezdova也指出，酶解消化往往會影響抗體結合的表位。“例如，貼壁細胞經過胰蛋白酶處理會導致鈣粘蛋白的切割和失活，使得對應的抗體難以識別其靶點。為了減少這些影響，使用更溫和的解離溶液是明智之舉，如Accutase?。”

無論采用哪種形式的解離，Fleischer都建議使用細胞濾網進行過濾，以去除樣品中的團塊。“大多數研究人員在流式分析中都遇到過進樣管堵塞的痛苦時刻，而細胞濾網是避免堵塞和外溢的關鍵工具，”他說。

4. 固定也需要優化

固定這個步驟也會影響抗體結合表位。一些抗體用于固定細胞染色時表現出信號損失。“我們對一些抗體克隆進行了內部測試，比較了未固定的細胞以及染色前用4%多聚甲醛固定的細胞，”Zvezdova說。“這些結果顯示了固定表位的染色是否有可能成功，如果您的抗體克隆未提供相關信息，我們通常建議在固定細胞前進行表面染色。”

溫度也會明顯影響抗體結合，導致趨化因子和細胞因子受體等表面蛋白的快速內化。如果要在固定前對細胞進行染色，那么在室溫或37℃下進行抗體孵育，而不是4℃。

5. Fc封閉可降低背景

抗體與免疫細胞上的Fc受體結合是造成背景染色的主要原因，會導致假陽性結果，或掩蓋低豐度靶點的存在。因此，在開展免疫染色之前，加入Fc封閉步驟。“盡管使用Fc封閉試劑可減少背景染色，但這會導致實驗操作中多了一步，并可能造成細胞損失，”Fleischer指出。

“為了讓Fc封閉不再成為必需，我們開發出了REAfinity?重組抗體。這些抗體的Fc區域經過改造，不再與Fc受體結合，能夠產生一致性更好的流式分析數據，”他說。

6. 巧用活細胞染料

Nanna Therapeutics的科學家Catherine Klapholz認為：“在樣品制備過程的多個階段進行細胞計數，以確認未出現明顯的細胞損失，這是一種明智的做法?；罴毎玖峡商峁┯杏玫男畔?，告知不同的制備技術對整個細胞群的影響。不過，必須測試染色的穩定性。數據采集有時需要1-2小時，并且是在室溫甚至4℃下，則信號有可能會急劇增加。”

無論我們對樣品制備過程采用多么精心的優化，但適用于A細胞的方案不一定適用于B細胞，正所謂“甲之蜜糖，乙之pi霜”。只有為每種細胞量身定制不同的樣品制備方案，我們的流式細胞分析才有可能獲得成功。