做蛋白研究的小伙伴都知道，一個(gè)完整的Western Blot包括了很多個(gè)步驟，從蛋白提取到配膠、上樣電泳，再到轉(zhuǎn)膜、封閉，后孵育一抗二抗后才能去進(jìn)行檢測(cè)。時(shí)間跨度非常長(zhǎng)，而且這中間的每一步都包含了很多的小細(xì)節(jié)，稍有不慎就會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出錯(cuò)，然后又得從頭來(lái)過(guò)。所以，關(guān)于WB，幾乎每一位經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)老手都有著一本厚厚的血淚史。

今天，小編就帶領(lǐng)大家簡(jiǎn)要梳理一遍WB流程中的一些細(xì)節(jié)，避免因某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯(cuò)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重做。

Western Blot概述

Western Blot采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)混合物，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)被到轉(zhuǎn)移到固相支撐物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持膜上蛋白質(zhì)或多肽的抗原性質(zhì)不變，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與其對(duì)應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，一抗再與酶標(biāo)記的二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色以檢測(cè)特異蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

由于Western blot技術(shù)服務(wù)具有簡(jiǎn)便，快捷等特點(diǎn)，所以目前該技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)。

一：樣品的獲取與制備

一般來(lái)說(shuō)我們檢測(cè)的樣品主要為細(xì)胞或者是組織，制備過(guò)程中盡量保持低溫。其次在制備時(shí)一定要根據(jù)目的蛋白的特性選擇合適的裂解液，比如對(duì)膜蛋白的提取、胞漿蛋白的提取和組織蛋白的提取等。

二：配膠、上樣及蛋白電泳

配置凝膠時(shí)一定要將膠板清洗干凈，用ddH2O或者無(wú)水乙醇潤(rùn)洗。晾干后根據(jù)蛋白分子量進(jìn)行不同濃度凝膠配制。上樣時(shí)需對(duì)蛋白進(jìn)行煮沸變性，如果進(jìn)行定量分析一定要將所有蛋白上樣量調(diào)至相同。電泳時(shí)低壓（80V）跑濃縮膠，高壓（120v）跑分離膠，至溴酚藍(lán)即將跑出膠面時(shí)終止電泳。

三：轉(zhuǎn)膜及封閉

轉(zhuǎn)膜時(shí)需提前配置好轉(zhuǎn)膜液并低溫放置。關(guān)于印跡膜來(lái)說(shuō)，目前大多實(shí)驗(yàn)室用的是PVDF膜，根據(jù)目的蛋白大小選擇合適的孔徑，大于20KDa的蛋白選用0.45μm的膜，小于20KDa的蛋白選用0.2μm的膜。PVDF膜在使用時(shí)需用甲醇處理活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電的蛋白結(jié)合。轉(zhuǎn)膜時(shí)一定要注意膜和凝膠的正反問(wèn)題，除此之外一定要注意凝膠和轉(zhuǎn)印膜間不要留有氣泡。封閉液可選擇5%的BSA或5%的脫脂奶粉，可以室溫封閉1-2h或者4℃過(guò)夜封閉。封閉時(shí)一定要注意對(duì)磷酸化的抗體或生物素標(biāo)記的抗體不能用脫脂奶粉封閉膜，只能用5% BSA。

四：抗體的孵育和檢測(cè)

一抗二抗的選擇一定要注意種屬來(lái)源問(wèn)題，如果這一步出錯(cuò)那前面的努力就相當(dāng)于白費(fèi)了。檢測(cè)方法可以選擇靈敏度超高的化學(xué)發(fā)光方法或者現(xiàn)在比較流行的熒光WB法。相較于傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光方法，熒光WB能夠?qū)崿F(xiàn)更精-準(zhǔn)的定量，還可以進(jìn)行多重檢測(cè)，只需要將不同的目的蛋白標(biāo)記上不同的熒光就可以了。基于目前各大期刊雜志對(duì)WB發(fā)表的要求，全蛋白定量是一種新的趨勢(shì)，熒光WB同樣可以實(shí)現(xiàn)全蛋白歸一化。