ELISA標準操作及技術(shù)服務的常見問題分析

　　一.ELISA 標準操作要點

　　的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA 檢測結(jié)果準確可靠的必要條件。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質(zhì)量的本公司要求使用的純化水電導率小于1.5μs/cm。

　　1. 標本的采取和保存

　　大部分ELISA 檢測均以血清為標本。血清標本可按常規(guī)方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP 為標記的ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應。一般說來，在5 天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需-20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。

　　抗凝不*的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。

　　2.加樣

　　加樣時應將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。

　　3.保溫

　　在建立ELISA 方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)

　　1-2 小時，產(chǎn)物的生成可達。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。

　　4.洗滌

　　洗滌在ELISA 過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA 操作中，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù)，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。

　　洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。

　　洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應按要求稀釋，所用的水電導率在1.5us/cm 之下，洗液如果結(jié)晶應待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為40 秒左右，孔內(nèi)液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。

　　5. 顯色和比色

　　TMB 經(jīng)HRP 作用后，約40 分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，至2 小時后即可*消退至無色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24 小時)不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指于測讀ELISA 結(jié)果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復性、度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30 分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。

　　測讀A 值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，*次在zui適波長(W1)，第二次在不敏感波長(W2)，兩次測定間不 移動ELISA 板的位置，zui終測得的A 值為兩者之差(W1-W2)。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

　　二.本底及假陽性產(chǎn)生的原因分析

　　1. 基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別

　　1.1 基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點：

　　a.分子量大。合成肽采用化學方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達到數(shù)百個氨基酸;而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。

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