細(xì)胞凍存和復(fù)蘇你應(yīng)該知道的小細(xì)節(jié)

　　在細(xì)胞培養(yǎng)檢測實驗在實驗儀器等工作上都要耗費不少的人力和體力。好在很久以前就有高人發(fā)明了細(xì)胞保存這個實驗步驟，將暫時多出來的細(xì)胞冰凍保存，保存細(xì)胞活力。細(xì)胞復(fù)蘇是一個簡單的試驗操作，但操作中也有許多需要注意的事項，在實驗操作中注意細(xì)小的問題，才能使復(fù)蘇后的細(xì)胞保持良好的狀態(tài)，針對細(xì)胞復(fù)蘇應(yīng)該注意以下幾點：

　　1. 可以提前把需要的體積的培養(yǎng)液放到培養(yǎng)瓶里，擰松瓶蓋，放到孵箱里30分鐘--1個小時;

　　2. 為防止凍存管在升溫時出現(xiàn)爆裂等情況，可以在放入水浴前就把超凈臺里的蓋子擰松一下然后再擰上;

　　3. 水浴溫度37℃左右。

　　一、慢凍程序

　　1. 標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細(xì)胞凍存器

　　當(dāng)溫度在-25 ℃以上時，1~2 ℃/min;

　　當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時，5~10 ℃/min;

　　當(dāng)溫度達(dá)-100℃時，可迅速放入液氮中。

　　2. 簡易程序：將冷凍管(管口要朝上)放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜，次日早晨投人液氮中。

　　3. 傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽長期儲存。

　　二、低溫保護劑的應(yīng)用

　　在細(xì)胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。

　　常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。

　　三、保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法

　　1. 快速解凍

　　凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化(不要超過3 分鐘)。

　　2. 解凍后的細(xì)胞可直接接種到生長培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。

　　3. 如果細(xì)胞對冷凍保護劑特別敏感

　　解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。

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