七色多重免疫熒光試劑盒(六標七色)

　　六色多重免疫疫熒光試劑盒(五標六色)50T 盒 5388

　　六色多重免疫疫熒光試劑盒(五標六色)100T 盒 8980

　　備注：二抗根據(jù)客戶要求羊抗兔或鼠兔通用二抗 染料： 綠光 紅光 古朵生物

　　原理介紹:酪酰胺信號放大(TSA，Tyramidesignalamplification)技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法，類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色方法，TSA技術(shù)同樣采用HRP標記的二抗，同樣有對應(yīng)的“顯色"步驟(HRP催化加入反應(yīng)體系的酪胺熒光素底物，產(chǎn)生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的LUOANSUAN等殘基共價結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定的共價結(jié)合酪胺熒光素。之后用熱修復(fù)法洗去非共價結(jié)合的一抗-二抗-HRP復(fù)合物，重復(fù)下一種一抗-hrp二抗來 第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復(fù)就可實現(xiàn)多重標記。

　　TSA詳細原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結(jié)合位點)，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括seansuan、zuansuan和nuoansuan 殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積，結(jié)果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡單來說，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯(lián)熒光素)，來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的nuoansuan殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復(fù)處理， 前一輪非共價結(jié)合的抗體被洗掉，共價結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價結(jié)合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，最后去檢測結(jié)果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔心抗體交叉反應(yīng)，以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設(shè)計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說，如果用TSA技術(shù)，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗，而且信號放大的倍數(shù)大大增強。本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種：480，520，570，620，690，780。此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。可以實現(xiàn)單標、雙標、三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能，極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。

　　試劑盒組成：480熒光染料(即用型，5mL),-20℃;520熒光染料(綠光)(即用型，5mL),-20℃;570熒光染料(紅光)(即用型，5mL)，-20℃;620熒光染料(即用型，5mL)，-20℃;690熒光染料(即用型，5mL)，-20℃;780熒光染料(即用型，5mL)，-20℃;TSA+增強劑，100ul，-20℃(可選);

　　高敏多聚hrp山羊抗兔二抗(20mL)4℃。

　　備注：480熒光染料、520熒光染料、570熒光染料、620熒光染料、690熒光染料、780熒光染料在-20度下，均為固體，使用之前需解凍。

　　TSA+增強劑使用方法：TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號5-10倍，TSA+增強劑：TYR熒光放大液=1:500，使用TSA+增強劑不是必須的選項，可以根據(jù)具體的情況選擇添加或者不選擇添加。

　　操作流程：

　　1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二jiabenⅠ15min-二jiabenⅡ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ。取出放在通風廚內(nèi)， 酒精晾干后放入自來水中稍洗，蒸餾水洗。

　　2、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿PH9.0EDTA堿性抗原修復(fù)液或者PH6.0檸檬酸修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)(也可以用高壓1-2min100度水煮15min95度水浴20min等其他熱修復(fù)方法)。中火8min，停火8min，轉(zhuǎn)中低火7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定)。

　　3、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入3%GUOGHUAQING，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

　　4、BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內(nèi)滴加用3%BSA-PBS(或者其他封閉液)均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

　　5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X， 切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜或者37度1-2h。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))

　　6、加hrp二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次， 每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min，PBS洗三次。

　　7、熒光染料反應(yīng)：XXX熒光染料反應(yīng)10-15min，PBS洗三次。

　　8、重復(fù)2-7步驟(換用另外一種XXX熒光染料)

　　9、DAPI復(fù)染細胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

　　10、封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌 3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

　　11、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。

　　染料激發(fā)波長發(fā)射波長

　　DAPI 藍色350  420

　　480   450   480

　　520 綠色490  520

　　570 紅色550   570

　　620    590   620

　　690    630   690

　　780   750   780