一、標本的制作

免疫熒光技術在實際應用上主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣品上直接滴加已知特異性熒光標記的抗血清，經洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結果。免疫熒光直接法可清楚地觀察抗原并用于定位標記觀察。間接法是在檢測樣品上滴加已知的細菌特異性抗體，待作用后經洗滌，再加入熒光標記的第二抗體。如研制成的抗沙門氏菌熒光抗體，用于750例食品樣品的檢測，結果表明與常規培養法的符合率基本一致。

在食品衛生檢疫中，熒光標記抗體檢測標本的制作應力求保持抗原的完整性，并在洗滌和固定過程中不發生溶解或變性。此外，為了便于抗原和抗體接觸形成抗原-抗體復合物，以及有利于觀察和記錄，要求制作的標本盡量薄，對標本中干擾抗原-抗體反應的物質應充分洗滌除去，以免影響標本的觀察以及結果的判定。

熒光標記抗體檢測標本的制作方法為：①涂片：先將載玻片通過火焰3次，冷卻后，挑取被檢材料涂布成直徑約1cm的圓形涂片，如材料太濃，也可將生理鹽水加入被檢材料中，混勻后均勻涂片。涂好后，晾干或以電風扇吹干備用；②固定：不同的抗原采用不同的固定劑，一般常用的固定劑為95%～100%乙醇和丙酮，固定的條件溫度為37℃、時間為3～15min，某些病毒最好以丙酮在-40～20℃下，固定30min，固定后應隨即用PBS反復沖洗，干后即可用于染色。固定的目的是防止標本從玻片上脫落，以及去除組織中妨礙抗原抗體結合的類脂質。

二、熒光抗體染色方法

1、直接法

直接法是指用特異熒光抗體直接滴加于待檢的標本上，由熒光標記的抗體與抗原發生特異結合（圖1-1）。標本中如有相應的抗原存在，即與熒光抗體特異性結合，在鏡下可見有熒光的抗原復合物。此法的優點是操作簡單、特異性高。其缺點是檢查每種抗原均需制備相應的特異性熒光抗體，且敏感性低于間接法。       

圖1-1　直接法示意圖

2、間接法

間接法是根據抗球蛋白試驗的原理，用熒光素標記抗球蛋白抗體（簡稱標記抗抗體）的方法（圖2-2）。間接法的檢測過程分為兩步：第一步，用未知未標記的抗體（待檢標本）加到已知抗原標本上，在濕盒中在37℃下保溫30min，使抗原抗體充分結合，然后洗滌，除去未結合的抗體；第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發生了抗原抗體反應，標記的抗球蛋白抗體就會和已結合抗原的抗體進一步結合，從而可鑒定未知抗體。由于結合在抗原-抗體復合物上的熒光素抗體增多，發出的熒光亮度強，因而其敏感性強。此外，它只需制備一種熒光抗體就可以檢出多種抗原，能用于檢測多種動物的多種抗原-抗體系統，而且能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查。此方法的缺點是易產生非特異性熒光，影響結果判斷。

 圖2-2　間接法示意圖

三、熒光顯微鏡檢查

標本經熒光抗體染色后，需要在熒光顯微鏡下觀察。熒光顯微鏡是免疫熒光化學的基本工具。它是由光源、濾板系統和光學系統等主要部件組成，是利用一定波長的光激發標本發射熒光，通過物鏡和目鏡系統放大以觀察標本的熒光圖像。在熒光顯微鏡檢查時，首先要選擇好的光源或濾光片，濾光片的正確選擇是獲得良好熒光觀察效果的重要條件。激發濾光片的作用是提供合適的激發光。根據光源和熒光色素的特點，可選用以下三類激發濾板，提供一定波長范圍的激發光。紫外光激發濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過；紫外藍光激發濾板：此濾板可使300～450nm范圍內的光通過；紫藍光激發濾板：它可使350～490nm的光通過；最大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達明色素）可用藍綠濾板激發。

熒光顯微鏡檢查的注意事項：①應在暗室中進行檢查，進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出的強光穩定后，眼睛*適應暗室，再開始觀察標本；②防止紫外光對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；③檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈的發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外光照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h；④熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源，天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數次點燃光源；⑤標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；⑥熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“一"——無或可見微弱熒光，“+"——僅能見明確可見的熒光，“++"——可見有明亮的熒光，“+++"——可見耀眼的熒光。

四、免疫熒光技術在食品檢驗中的應用

食品免疫檢測技術是食品分析檢測領域的新熱點，在殘余藥物、殘余農藥、有害微生物等的檢測方面取得了顯著進展。免疫檢測技術是基于抗原-抗體反應的原理對待測物進行定量定性分析的檢測方法，具有特異性強、靈敏度高、簡便等優點。下文將以紅細胞抗體混合熒光抗體染色法對食品中沙門氏菌的檢測為例，說明免疫熒光抗體在食品檢驗中的應用。

1、原理

將抗體球蛋白稀釋成2mg/mL，和2%綿羊紅細胞1∶1混合（混合后血球成1%），再加依文斯蘭2滴（0.1%）。這樣的懸液里和血球表面帶有沙門氏菌的抗體，加上增菌液，在濕的環境下使抗原和抗體結合，其余的雜質和非特異的物質不與抗體結合，不易固定在玻片上，易被水沖擊。因此，有特異性的抗原就能滯留在玻璃片上。

紅細胞經過鞣化處理后有一定的吸附作用，能將抗體（包括熒光標記的抗體）吸附在血球上，使血球呈黃綠色（如在熒光血清中加依文斯蘭可使血球呈紅色），這樣在玻璃片上呈現出清晰的背景，鏡檢時見到血球后可鑒定特異性細菌的存在。因為此法有吸附抗體的作用，所以抗原也不易漏去，這是熒光抗體的優點。

2、方法

（1）取10%戊二醛血球懸液0.3mL于10mL刻度離心管中用2mL生理鹽水洗兩次（2500r/min，5min）。將沉淀血球配成2%血球懸液，以1∶20000鞣酸生理鹽水1∶1混合，置37℃水浴中15min鞣化。

（2）將提純的伽馬球蛋白稀釋成2mg/mL，和以上血球1∶1混合。此時血球為1%球蛋白，為1mg/mL。

（3）將以上懸液涂于玻片上（每片8點），在酒精燈上用火焰干燥固定后，加被檢的增菌液于涂片點上，37℃濕盒中30min。

（4）沖洗玻片后加沙門氏菌熒光抗血清，37℃，30min在濕盒染色。

（5）洗片：用間接法洗較好，待干后鏡檢。

3、結果判定

亮度：

#　表示菌形清晰，亮環顯著，發閃亮黃綠色熒光。

+++　表示菌形清晰，亮環顯著，亮度較強。

++　表示菌形成形，有亮環，亮度較差。

+　表示菌體可有些形態，亮環清楚，熒光微弱。

-　表示無熒光。

菌量：

#　表示視野中菌體密布。

+++　表示視野中菌體較密。

++　表示視野中菌體稀散。

+　表示視野中僅見個別菌體或在數個視野中僅見個別少數菌體。

-表示無典型菌體。

判定：

+　表示陽性。

±　表示可疑，再做第二次染色如仍可疑做常規。

-　表示陰性。

一、標本的制作

免疫熒光技術在實際應用上主要有直接法和間接法。直接法是在檢測樣品上直接滴加已知特異性熒光標記的抗血清，經洗滌后在熒光顯微鏡下觀察結果。免疫熒光直接法可清楚地觀察抗原并用于定位標記觀察。間接法是在檢測樣品上滴加已知的細菌特異性抗體，待作用后經洗滌，再加入熒光標記的第二抗體。如研制成的抗沙門氏菌熒光抗體，用于750例食品樣品的檢測，結果表明與常規培養法的符合率基本一致。

在食品衛生檢疫中，熒光標記抗體檢測標本的制作應力求保持抗原的完整性，并在洗滌和固定過程中不發生溶解或變性。此外，為了便于抗原和抗體接觸形成抗原-抗體復合物，以及有利于觀察和記錄，要求制作的標本盡量薄，對標本中干擾抗原-抗體反應的物質應充分洗滌除去，以免影響標本的觀察以及結果的判定。

熒光標記抗體檢測標本的制作方法為：①涂片：先將載玻片通過火焰3次，冷卻后，挑取被檢材料涂布成直徑約1cm的圓形涂片，如材料太濃，也可將生理鹽水加入被檢材料中，混勻后均勻涂片。涂好后，晾干或以電風扇吹干備用；②固定：不同的抗原采用不同的固定劑，一般常用的固定劑為95%～100%乙醇和丙酮，固定的條件溫度為37℃、時間為3～15min，某些病毒最好以丙酮在-40～20℃下，固定30min，固定后應隨即用PBS反復沖洗，干后即可用于染色。固定的目的是防止標本從玻片上脫落，以及去除組織中妨礙抗原抗體結合的類脂質。

二、熒光抗體染色方法

1、直接法

直接法是指用特異熒光抗體直接滴加于待檢的標本上，由熒光標記的抗體與抗原發生特異結合（圖1-1）。標本中如有相應的抗原存在，即與熒光抗體特異性結合，在鏡下可見有熒光的抗原復合物。此法的優點是操作簡單、特異性高。其缺點是檢查每種抗原均需制備相應的特異性熒光抗體，且敏感性低于間接法。       

圖1-1　直接法示意圖

2、間接法

間接法是根據抗球蛋白試驗的原理，用熒光素標記抗球蛋白抗體（簡稱標記抗抗體）的方法（圖2-2）。間接法的檢測過程分為兩步：第一步，用未知未標記的抗體（待檢標本）加到已知抗原標本上，在濕盒中在37℃下保溫30min，使抗原抗體充分結合，然后洗滌，除去未結合的抗體；第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發生了抗原抗體反應，標記的抗球蛋白抗體就會和已結合抗原的抗體進一步結合，從而可鑒定未知抗體。由于結合在抗原-抗體復合物上的熒光素抗體增多，發出的熒光亮度強，因而其敏感性強。此外，它只需制備一種熒光抗體就可以檢出多種抗原，能用于檢測多種動物的多種抗原-抗體系統，而且能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查。此方法的缺點是易產生非特異性熒光，影響結果判斷。

 圖2-2　間接法示意圖

三、熒光顯微鏡檢查

標本經熒光抗體染色后，需要在熒光顯微鏡下觀察。熒光顯微鏡是免疫熒光化學的基本工具。它是由光源、濾板系統和光學系統等主要部件組成，是利用一定波長的光激發標本發射熒光，通過物鏡和目鏡系統放大以觀察標本的熒光圖像。在熒光顯微鏡檢查時，首先要選擇好的光源或濾光片，濾光片的正確選擇是獲得良好熒光觀察效果的重要條件。激發濾光片的作用是提供合適的激發光。根據光源和熒光色素的特點，可選用以下三類激發濾板，提供一定波長范圍的激發光。紫外光激發濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過；紫外藍光激發濾板：此濾板可使300～450nm范圍內的光通過；紫藍光激發濾板：它可使350～490nm的光通過；最大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達明色素）可用藍綠濾板激發。

熒光顯微鏡檢查的注意事項：①應在暗室中進行檢查，進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出的強光穩定后，眼睛*適應暗室，再開始觀察標本；②防止紫外光對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；③檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈的發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外光照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h；④熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源，天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數次點燃光源；⑤標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；⑥熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“一"——無或可見微弱熒光，“+"——僅能見明確可見的熒光，“++"——可見有明亮的熒光，“+++"——可見耀眼的熒光。

四、免疫熒光技術在食品檢驗中的應用

食品免疫檢測技術是食品分析檢測領域的新熱點，在殘余藥物、殘余農藥、有害微生物等的檢測方面取得了顯著進展。免疫檢測技術是基于抗原-抗體反應的原理對待測物進行定量定性分析的檢測方法，具有特異性強、靈敏度高、簡便等優點。下文將以紅細胞抗體混合熒光抗體染色法對食品中沙門氏菌的檢測為例，說明免疫熒光抗體在食品檢驗中的應用。

1、原理

將抗體球蛋白稀釋成2mg/mL，和2%綿羊紅細胞1∶1混合（混合后血球成1%），再加依文斯蘭2滴（0.1%）。這樣的懸液里和血球表面帶有沙門氏菌的抗體，加上增菌液，在濕的環境下使抗原和抗體結合，其余的雜質和非特異的物質不與抗體結合，不易固定在玻片上，易被水沖擊。因此，有特異性的抗原就能滯留在玻璃片上。

紅細胞經過鞣化處理后有一定的吸附作用，能將抗體（包括熒光標記的抗體）吸附在血球上，使血球呈黃綠色（如在熒光血清中加依文斯蘭可使血球呈紅色），這樣在玻璃片上呈現出清晰的背景，鏡檢時見到血球后可鑒定特異性細菌的存在。因為此法有吸附抗體的作用，所以抗原也不易漏去，這是熒光抗體的優點。

2、方法

（1）取10%戊二醛血球懸液0.3mL于10mL刻度離心管中用2mL生理鹽水洗兩次（2500r/min，5min）。將沉淀血球配成2%血球懸液，以1∶20000鞣酸生理鹽水1∶1混合，置37℃水浴中15min鞣化。

（2）將提純的伽馬球蛋白稀釋成2mg/mL，和以上血球1∶1混合。此時血球為1%球蛋白，為1mg/mL。

（3）將以上懸液涂于玻片上（每片8點），在酒精燈上用火焰干燥固定后，加被檢的增菌液于涂片點上，37℃濕盒中30min。

（4）沖洗玻片后加沙門氏菌熒光抗血清，37℃，30min在濕盒染色。

（5）洗片：用間接法洗較好，待干后鏡檢。

3、結果判定

亮度：

#　表示菌形清晰，亮環顯著，發閃亮黃綠色熒光。

+++　表示菌形清晰，亮環顯著，亮度較強。

++　表示菌形成形，有亮環，亮度較差。

+　表示菌體可有些形態，亮環清楚，熒光微弱。

-　表示無熒光。

菌量：

#　表示視野中菌體密布。

+++　表示視野中菌體較密。

++　表示視野中菌體稀散。

+　表示視野中僅見個別菌體或在數個視野中僅見個別少數菌體。

-表示無典型菌體。

判定：

+　表示陽性。

±　表示可疑，再做第二次染色如仍可疑做常規。

-　表示陰性。