新一代測序（NGS）技術(shù)的應(yīng)用日益廣泛。隨著測序技術(shù)的不斷改進(jìn)，制備核酸和構(gòu)建NGS文庫的方法也在改進(jìn)。對于各種文庫制備方法，總的來說，在NGS分析之前，制備RNA或DNA的主要步驟包括：片段化和/或篩分長度的目標(biāo)序列；將目標(biāo)片段轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA；在片段末端連上寡核苷酸接頭；以及定量zui終的文庫。
NGS文庫構(gòu)建的主要因素。主要是通過物理方法（如超聲破碎）或酶學(xué)方法（即非特異的核酸內(nèi)切酶處理）來實現(xiàn)的。將這兩種方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)它們都很有效。不過，與物理方法相比，ELISA試劑盒酶學(xué)方法（Fragmentase）產(chǎn)生更多人為的插入缺失。認(rèn)為它能夠減少樣品處理并節(jié)約時間。在制備DNA樣品的文庫時，應(yīng)考慮幾點，包括起始材料的量以及測序應(yīng)用。若基因組的GC含量較高或較低，文庫制備有可能會出現(xiàn)偏向。此時應(yīng)精心選擇PCR擴增的酶、條件以及緩沖液，來解決這些問題。
這些可從微克至皮克級的起始材料開始制備文庫。不過，大家應(yīng)該記住這一點，起始材料越多，意味著擴增越少，文庫復(fù)雜性越好。對于RNA測序?qū)嶒灒跊Q定文庫制備的方法之前應(yīng)考慮實驗的主要目的。如果目的是發(fā)現(xiàn)復(fù)雜和整體的轉(zhuǎn)錄事件，那么文庫應(yīng)捕獲整個轉(zhuǎn)錄組，包括編碼、非編碼和基因間RNA，盡可能完整。然而，在很多情況下，ELISA試劑盒此外，制備測序文庫時的主要目標(biāo)是產(chǎn)生盡可能少的偏向（bias）。偏向可被定義為因?qū)嶒炘O(shè)計而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)系統(tǒng)失真。既然不可能消除所有來院的實驗偏向，那么至少要了解偏向發(fā)生在哪里，并采取一切可行的步驟來盡量減少；注意實驗設(shè)計，讓不可能消除的偏向?qū)ui終分析的影響zui小。
