制藥企業(yè)生產(chǎn)車間、實驗室潔凈區(qū)的微生物污染與污染源密切相關(guān)，細菌、真菌、病毒性污染等較為常見，主要由潔凈環(huán)境和設(shè)施管理不當(dāng)、人員不規(guī)范的行為與交叉污染、操作菌株的泄露、原輔料混入、設(shè)備與容器污染等原因造成。因而選擇一種可靠的潔凈區(qū)微生物檢測方法，可以有效監(jiān)控潔凈區(qū)的環(huán)境，控制微生物污染的風(fēng)險，確保微生物監(jiān)測結(jié)果的可靠性和準確性，體現(xiàn)潔凈區(qū)環(huán)境微生物控制的真實水平。
1、培養(yǎng)基
培養(yǎng)基是微生物試驗的基礎(chǔ)，直接影響微生物試驗結(jié)果。適宜的培養(yǎng)基制備方法、貯藏條件和質(zhì)量控制試驗是提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證。
在微生物檢測時，我們應(yīng)該高度重視所使用的培養(yǎng)基（包括購置不同批號的成品預(yù)裝培養(yǎng)基、不同批次的脫水培養(yǎng)基干粉、按照處方使用不同批次的原材料自行配制培養(yǎng)基等）、制備程序（包括水質(zhì)控制、配制方法、滅菌程序等）、貯藏條件（溫濕度、時間及盛裝培養(yǎng)基的容器條件等）等是否滿足微生物檢測用要求。
無論是做潔凈區(qū)沉降菌、浮游菌，還是表面微生物，所使用的培養(yǎng)基平皿在使用之前都必須對使用批次的培養(yǎng)基平皿做促生長試驗，這也是培養(yǎng)基的性能試驗，更是培養(yǎng)基的內(nèi)在質(zhì)量標準。它是用已知的標準菌株按照規(guī)程和標準測定培養(yǎng)基性能是否符合要求。
在這個實驗中，我們不能忽略的一個環(huán)節(jié)，就是需要使用對照培養(yǎng)基。關(guān)于對照培養(yǎng)基，在《中國藥典》中借鑒歐美藥典，引入培養(yǎng)基適用性檢查以保障微生物限度檢查結(jié)果的準確性和可靠性。
但是，對于歐美藥典中的“之前驗證過的培養(yǎng)基"的采納與否，存在很大爭議，集中在兩點。第一，我國藥品微生物實驗室小而分散，數(shù)以千計的企業(yè)和基層藥檢所難以有效地進行對照培養(yǎng)基的驗證、評價工作；第二、在監(jiān)督檢查中，難以有效評估企業(yè)微生物實驗室對對照培養(yǎng)基的驗證情況，以統(tǒng)一的、經(jīng)過充分評價和驗證過的對照培養(yǎng)基進行培養(yǎng)基的適用性試驗。
所以我們在使用對照培養(yǎng)基過程中，應(yīng)該注意：
在保證配制和滅菌過程無誤的條件下，對照培養(yǎng)基可以不經(jīng)適用性實驗檢查直接用于樣品檢查。
不同處方培養(yǎng)基的替代使用不能通過培養(yǎng)基適用性試驗簡單確定，要按標準規(guī)定使用培養(yǎng)基。
不建議使用經(jīng)過對照培養(yǎng)基進行適用性試驗檢查合格的其它培養(yǎng)基作為實驗室自用的“對照培養(yǎng)基"。
如果沒有特殊規(guī)定，培養(yǎng)基配制采用蒸餾水或純化水均可，但應(yīng)進行檢測控制。
干粉培養(yǎng)基或培養(yǎng)基原料變質(zhì)不應(yīng)再用；成品培養(yǎng)基儲存過程發(fā)現(xiàn)變色、長菌、嚴重脫水等也不應(yīng)再用。
2、潔凈區(qū)微生物檢測
制藥企業(yè)在評估生產(chǎn)潔凈環(huán)境的微生物狀況時，需對潔凈環(huán)境進行動態(tài)或靜態(tài)監(jiān)測，使用沉降菌平皿、空氣浮游菌平皿和表面接觸皿對潔凈區(qū)微生物檢測。其中浮游菌和沉降菌的檢測根據(jù)GB16293-2010《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))浮游菌的測試方法》和GB16294-2010《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌的測試方法》規(guī)定進行檢測。表面微生物檢測方法有擦拭法和表面接觸碟法。
2.1沉降菌取樣
沉降菌檢測方法采用沉降法，即通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養(yǎng)基平皿，經(jīng)過若干時間，在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落進行計數(shù)，以平板培養(yǎng)基皿中的菌落數(shù)來判斷結(jié)晶環(huán)境內(nèi)活微生物數(shù)，并以此來評定潔凈區(qū)的潔凈度。
取樣方法：環(huán)境監(jiān)控人員用消毒劑消毒雙手，取出TSA平皿，按照采樣點布置圖逐個放置，然后從里到外逐個打開培養(yǎng)皿蓋，并將蓋內(nèi)側(cè)向下放在培養(yǎng)皿底座旁邊，使培養(yǎng)基表面暴露在空氣中。為了避免污染培養(yǎng)基表面，手和手臂不要經(jīng)過已開蓋的培養(yǎng)皿上方。
2.2浮游菌取樣
浮游菌取樣是通過空氣采樣儀收集懸浮在空氣中的生物性粒子于專門的培養(yǎng)基，經(jīng)若干時間和適宜的生長條件讓其繁殖到可見的菌落并計數(shù)，以判定該潔凈區(qū)的微生物濃度。
浮游菌采樣器一般采用撞擊法機理，可分為狹縫式采樣器、離心式或針孔式采樣器。
狹縫式采樣器由內(nèi)部風(fēng)機將氣流吸入，通過采樣器的狹縫式平板，將采集的空氣噴射并撞擊到緩慢旋轉(zhuǎn)的平板培養(yǎng)基表面上，附著的活微生物粒子經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。
離心式采樣器由于內(nèi)部風(fēng)機高速旋轉(zhuǎn)，氣流從采樣器前部吸入從后部流出，在離心力的作用下，空氣中的活微生物粒子有足夠的時間撞擊到專用的固形培養(yǎng)條上，附著的活微生物粒子經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。
針孔式采樣器是氣流通過一個金屬蓋吸入，蓋子上是密集的經(jīng)過機械加工的特制小孔，通過風(fēng)機收集到細小的空氣流直接撞擊到平板培養(yǎng)基表面上，附著的活微生物粒子經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。
目前大部分制藥企業(yè)采用針孔式采樣器進行浮游菌采樣，故介紹一下其取樣方法。
取樣方法（針孔式采樣器）：
環(huán)境監(jiān)控人員應(yīng)首先確定空氣采樣器在校驗合格的范圍內(nèi)；
采樣前，用經(jīng)消毒劑浸濕的無菌布擦拭空氣采樣器的外表面，并讓其自然揮干；
準備好一個已滅菌好的采樣器蓋子，滅菌后的采樣蓋子僅能使用一次；
環(huán)境監(jiān)控人員用消毒劑消毒雙手，取出TSA平皿，將培養(yǎng)皿正置于頂部的支撐面上，將蓋子打開放置在一邊，打開消毒袋，取出多孔采集蓋，蓋到采樣器上，開始采集空氣樣品；
每個取樣點，用一塊TSA培養(yǎng)基平皿，取樣量1000升；
取樣結(jié)束后，在培養(yǎng)基平皿上標示相關(guān)信息，如房間號、檢測項目、級別及班次、取樣日期等。
注意：在采樣過程中，不要將任何物體（包括操作人員的手和頭）置于培養(yǎng)基平皿上方，避免在取樣點附近活動。
2.3表面微生物取樣
表面微生物的取樣有兩種方法，即擦拭法和表面接觸碟法。
擦拭法是一種常用的表面微生物取樣方法，在沒有表面接觸平皿法之前，潔凈區(qū)表面微生物取樣幾乎都采用這種方法，常用于設(shè)備表面取樣，優(yōu)點是能對彎曲表面直接取樣。通過考察有代表性部位的微生物水平評價設(shè)備污染狀況，另外還常用于設(shè)備的清潔驗證中。但擦拭取樣法有其局限性，它的微生物回收率通常受取樣工具、溶解溶劑、取樣人員、檢測方法等因素的影響。
具體操作方法：將棉簽按在取樣表面上，用力使其彎曲，平穩(wěn)而緩慢的擦拭取樣表面，在向前移動的同時將其從一邊移動到另一邊。擦拭過程應(yīng)覆蓋整個表面，翻轉(zhuǎn)棉簽，讓棉簽的另一面也進行擦拭，但與前次擦拭移動方向垂直，至少需擦拭25cm2的區(qū)域。
表面接觸碟法是在擦拭法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，采用直徑為55mm的接觸皿對被取樣表面進行接觸取樣。平皿應(yīng)裝滿一種體積可控的瓊脂培養(yǎng)基（根據(jù)目標微生物選擇），為表面采樣特制。瓊脂應(yīng)在培養(yǎng)皿上形成凸起彎月面，即檢測人員打開平皿后，用培養(yǎng)基表面輕輕接觸取樣點表面，注意不要旋轉(zhuǎn)，取樣完畢后立即蓋上平皿蓋，接觸過程大約5s，取樣結(jié)束后用消毒劑浸濕的無菌潔凈布擦拭取樣點。
3、注意事項
對于單向流潔凈區(qū)或送風(fēng)口，采樣器采樣口朝向應(yīng)正對氣流方向；對非單向流潔凈區(qū)，采樣口向上。
布置采樣點時，至少應(yīng)盡量避開塵粒較集中的回風(fēng)口。
采樣時，環(huán)境監(jiān)控人員應(yīng)站在采樣口的下風(fēng)側(cè)，并盡量少動。
應(yīng)采取一切措施防止采樣過程的污染和其他可能對樣品的污染。
培養(yǎng)皿在用于檢測時，為避免培養(yǎng)皿運輸或搬動過程造成的影響，宜同時進行陰性對照試驗，每次或每個區(qū)域取一個對照皿，與采樣皿同法操作，但不需暴露采樣，然后與采樣后的培養(yǎng)皿（TSA、SDA）一起放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，結(jié)果應(yīng)無菌落生長。
