Jackson公司熒光免疫印跡前言：

熒光蛋白質印跡可以為已經很強大的蛋白質檢測技術提供許多優勢。二抗與熒光染料（如 Alexa Fluor ® ）偶聯， 產生可使用數字成像儀檢測的信號。該技術靈敏度高，可定量使用，無需剝離和重新探測即可在同一印跡上進行多重檢測。

與比色法和化學發光蛋白質印跡法一樣，熒光蛋白質印跡法使用抗原-抗體復合物來檢測通過電泳分離后固定在印跡膜上的特定蛋白質。蛋白質的可視化是通過使用配備適當光源的成像系統激發熒光染料來實現的。熒光染料在其激發波長處吸收光，然后在其發射波長處釋放光子，使分子返回其基電子態。然后由配備正確濾光片的數字成像儀檢測熒光分子（熒光團）發出的光。

Jackson公司：與化學發光和比色檢測相比，熒光蛋白質印跡具有許多優勢。

Jackson公司：多重檢測——在一次印跡上檢測多種蛋白質

熒光印跡使多重蛋白質印跡分析變得容易實現， 因為 可以在同一個印跡上同時檢測和區分多種蛋白質。針對在不同物種中產生的一抗的染料偶聯二抗可用于標記每種特定抗原 （蛋白質）具有其自身發射波長的染料——光譜特性。光譜上不同的染料被數字成像儀激發并以其特征波長發光，從而允許在同一個印跡上檢測到兩種或三種不同的蛋白質（圖 2）。這提供了優于化學發光和比色檢測的優勢，化學發光和比色檢測在查看多個目標時需要剝離和重新探測印跡。熒光檢測允許定量使用印跡，因為印跡上的蛋白質不受刺激性剝離化學品的干擾。另一個好處是通過電泳分辨不好的蛋白質的可視化，因為不能很好地分離大小的蛋白質可以通過顏色來區分。

定量的

產生的信號量與存在的蛋白質量成正比。當與寬動態范圍相結合時，可以定量使用優化的熒光蛋白質印跡，因為可以在同一個印跡上檢測低豐度和高豐度蛋白質而無需飽和檢測。

Jackson公司：靈敏度和魯棒性

Alexa Fluor ® 680 和 790（圖 2）等遠紅和紅外熒光染料偶聯物由于低熒光猝滅、高消光系數和低背景自發熒光而提供更高的靈敏度。它們可用于高靈敏度、定量和凝膠內 Western 印跡以及 microWestern、細胞內和細胞內 Western 陣列以及其他需要最亮染料的技術。由于良好的穩定性，印跡可能會被存檔和重新成像。

Jackson公司：熒光斑點印跡

一種非常簡單和快速的免疫技術，可用于優化檢測限和篩選大量樣品是斑點印跡。當分析物的遷移已經被表征時，斑點印跡是一種快速而簡單的方法來篩選多個樣品中是否存在感興趣的蛋白質。網格系統的使用可以確定檢測靈敏度，而無需在多個蛋白質印跡中轉移的可變性。使用熒光染料可以在同一印跡上確認樣品中存在一種或多種分析物。

注意：與化學發光蛋白質印跡法一樣，熒光印跡法需要優化以改善對背景噪聲信號的檢測。背景可能來自用于印跡的材料，因此選擇不具有熒光特性的材料很重要。聚丙烯酰胺電泳凝膠和印跡膜（硝酸纖維素和 PVDF）可能具有熒光特性，可導致顯著背景。使用檢測儀器上可用的各種過濾器選項觀察未染色的凝膠或膜，如果可能，選擇在膜不自發熒光的區域發光的熒光染料。

低信號可能是由于低抗原（由于低蛋白表達、降解或印跡膜過度清洗），并且隨后的熒光標記將低，即使二抗具有放大優勢。信號也可以由于熒光猝滅而降低，如果熒光標記太高，信號會因 F?rster 共振能量轉移 (FRET) 而減弱。與化學發光印跡相比，數字成像儀可以有效優化檢測條件，化學發光印跡需要反復曝光才能優化。

備注：

圖1：間接熒光檢測。A. 熒光染料偶聯二抗可檢測目的蛋白的一抗。B. 光用于在其激發波長激發熒光偶聯物。C. 激發的熒光染料在其發射波長處發射光，通過數字成像儀檢測到該光，從而使感興趣的蛋白質可視化。

圖2：無需剝離和重新探測即可對多個蛋白質靶標進行多重檢測。使用 Alexa Fluor ® 680 遠紅染料和 Alexa Fluor ® 790 紅外染料對蛋白質印跡進行雙重免疫熒光染色。小鼠 IgG 用 β-巰基乙醇和 SDS 還原和變性。重鏈和輕鏈通過 SDS-PAGE 分離，轉移到硝酸纖維素上，并用 1:100,000 稀釋的 Alexa Fluor® 790-山羊抗小鼠 IgG、Fcγ 亞類 1 特異性（min X Hu、Bov、Rb Sr Prot, 115-655-205)（綠色）檢測 50 kDa 重鏈和 1:100,000 稀釋的 Alexa Fluor®680-山羊抗小鼠 IgG，輕鏈特異性（min X Bov、Gt、Hrs、Hu、Rb、Rat、Shp Ig、115-625-174）（紅色）檢測 25 kDa 的輕鏈）。熒光在 LiCor Odyssey 成像儀中成像。

圖 3：熒光點印跡。使用 Alexa Fluor ® 488 Goat anti-Rabbit IgG (H +L) 檢測到 ChromPure Rabbit IgG ( H+L)。應用蛋白質后，使用 5% 牛血清白蛋白封閉膜。1秒曝光；過濾器 525; 藍色LED模組燈；3×3 分箱。

表 1：根據您的數字成像儀的設置，從紫外到紅外的熒光染料可能兼容用于熒光蛋白質印跡。對于多重檢測，重要的是選擇光譜不同且沒有重疊光譜的染料。

Jackson公司專注于親和純化的二抗和純化免疫球蛋白研究，服務領域覆蓋各大學科研所和醫院里的動物研究以及生物醫學研究機構的科學家。艾美捷科技是Jackson公司的中國代理商，為科研工作者提供優質的產品與服務。